什么是RTqPCRRNA一站 [复制链接]

RT-qPCR包括三大步骤：RNA的提取与质量检测、逆转录成cDNA、以及实时荧光定量PCR实验。通过RT-qPCR实验，可以合成cDNA探针、获取目的基因、以及分析基因的转录水平。

RNA的提取与质量检测

从细胞、组织等样本中提取出RNA后，需要对提取的RNA的纯度、浓度、以及完整性进行评估，质检达标后才能进行后续的实验。一般需要通过紫外分光光度法（Nanodrop仪器）检测RNA的浓度和纯度；Agilent仪器分析RIN值检测RNA的完整性；以及琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否有基因组污染和其他杂质污染。

1.RNA的浓度纯度检测（吸光度法）

由于RNA具有共轭结构，可以吸收紫外光，故测定RNA溶液在60nm的吸光度值，可计算出RNA的含量。其中纯度高的RNA，A60/A80比值应在1.9~.之间，若比值＞.，表明可能有异硫氰酸，若比值1.9，表明有蛋白质、酚等污染；建议重新提取RNA。

.RNA完整性检测（Agilent分析）

RIN值大小反映样品的完整性，一般RIN值在5~10之间，数值越接近10表明RNA完整性越高，反之RIN值越小完整性越差（特殊样品需结合基线综合评估）。Agilent检测不仅可以得到样品RIN值，还可以得到样品浓度以及8S/18S比值（原核生物是3S/16S）。

图1：RNA完整性指标

3.基因组及其他杂质污染检测（凝胶电泳）

真核生物RNA特有8S、18S、5S三条带，进行琼脂糖凝胶电泳分析时，8S条带的亮度大概是18S条带的两倍或者以上，且无拖尾，说明RNA的完整性高、未被其他杂质污染。若出现其他条带、或者条带弥散拖尾，建议重新提取RNA。

图：真核生物完整的RNA琼脂糖凝胶电泳图

总之，RNA提取的原则：

①　保证RNA一级结构的完整性；

②　不存在对酶存在抑制作用的有机溶剂，以及过高浓度的金属离子污染；

③　其他蛋白质、多糖和脂类污染；

④　排除其他核酸分子（DNA、游离核苷酸等）污染。

图3：提取50mg不同组织中的RNA。Lane1：番茄果；Lane：南瓜叶；Lane3：玉米根；Lane4：南瓜茎；Lane5：丝瓜花；Lane6：水稻种子。